PubPeer 评论梳理 | 长链非编码 RNA Nron 抗骨质疏松功能基序

2021 年发表于 Nature Communications 的一项研究提出，长链非编码 RNA Nron 的一个功能基序具有抗骨质疏松作用。2026 年 6 月，PubPeer 上出现了 4 条评论，包括质疑、作者回应以及再回应。以下按评论编号梳理各方观点，供读者自行判断。

评论 #1：多图数据异常与规律性数值模式

评论者 Amphiura duncani 指出，论文中多组数据存在显著异常，并列出以下五个方面：

【1】Fig 2e 与 Fig 7e 中 BV/TV 值后四位小数完全相同

评论者注意到，Figure 2e 和 Figure 7e 中显示的数据存在显著异常。如黄色高亮所示，两个图中 BV/TV (%) 值的后四位小数完全相同。这两个实验代表完全独立的研究系统（基因敲除模型 vs 卵巢切除诱导的骨质疏松模型），涉及不同的动物、处理和目标；如此多的紧密对应关系相当不可能。

【2】Suppl. Figure 5a 中三个 Nron 值完全相同

在源数据中，Suppl. Figure 5a 的 Nron 值第四列有三个数值完全相同。由于生物学重复通常存在变异系数（一般为 5–20%），三个完全相同的值相当不可能。

【3】多组补充图中存在大量重复数字

在 Suppl. Figure 2f、Suppl. Figure 2h、Suppl. Figure 8b、Suppl. Figure 9b、Suppl. Figure 11c 的源数据中，同一组内（红色标记）和不同组间（绿色标记）存在大量重复数字。评论者用相应颜色的框标记了若干组。鉴于显著的个体差异，不同独立样本即使在同一组内也必须表现出数值波动。在正确进行的体内动物生物学实验中，大批独立样本中出现相同值的统计概率接近于零，无法用实验误差合理解释。

【4】仅整数部分不同而小数部分相同

在 Suppl. Figure 5c、Suppl. Figure 8b、Suppl. Figure 10b 的源数据中，同一组内（红色标记）和不同组间（绿色标记）存在大量仅整数部分不同而小数部分相同的数字。鉴于实验测量本身涉及随机变异，小数部分的精确保持在统计上是不可能的。

【5】存在固定常数算术线性规则

在 Suppl. Figure 5c、Suppl. Figure 8b、Suppl. Figure 9b、Suppl. Figure 11c 的源数据中，存在大量遵循固定常数算术线性规则的值（紫色标记）。评论者用相应颜色的框标记了若干组。基本上，真实的测量数据受随机个体变异和仪器误差影响，不可能遵循严格的固定常数算术规则。

在 Suppl. Figure 5c 中，空白对照组（第 1 列）和 Nron 过表达组（第 2 列）第三次独立实验的值，可以通过在第一次实验对应值上加上固定常数 0.09593023 精确计算得到。

在 Supplementary Figure 8b 中，Vector 对照组第 1 次和第 2 次独立重复的定量 TUNEL 阳性破骨细胞百分比值，可以通过统一乘以固定常数 2.25 精确转换为 NCM2 处理组相同两次重复的对应值；Nron 处理组第 2 个和第 3 个值，可以通过统一乘以固定常数 1.5 精确转换为 Nron 处理组第 4 个值和 NCM2 处理组第 1 个值。

在 Supplementary Figure 9b 中，Sham（假手术对照）组核心定量骨量指标 BV/TV(%) 的第 1 个和第 2 个独立小鼠样本测量值，可以通过统一减去固定常数 0.55 精确转换为同一组第 4 个和第 5 个独立样本的对应值。同时，对于骨小梁厚度（Tb.Th, mm），Sham 组第 1 个和第 2 个值减去固定常数 0.0059，恰好与 OVX-Vector 组第 3 个和第 4 个值匹配；OVX-Vector 组第 1 个和第 2 个值加上固定常数 0.0016，恰好等于 OVX-Zol 组第 4 个和第 5 个值。

对于 Supplementary Figure 11c 中的 Tb.Th (mm)，Sham 组第 3 个和第 4 个值加上固定常数 0.0015，恰好对应 OVX-Vector 组第 4 个和第 5 个值；Sham 组第 4 个和第 5 个值减去固定常数 0.0099，恰好等于 OVX 组第 3 个和第 4 个值。

评论 #2：作者回应

作者 Yao Sun 对上述质疑作出回应。作者认为，评论者提出的问题主要源于对本研究实验流程和原始数据缺乏透彻理解，且未与作者进一步沟通、讨论或验证数据来源和真实性，导致基于不对称信息的初步判断。作者逐条提供了客观答复和详细解释，并表示接受公众监督，欢迎深入科学讨论。

Response to #1

本节包括 Nronflox/flox 组（Figure 2e）和 sham 组（Figure 7e）各 6 只小鼠的实验。所有动物均为相同品系和遗传背景，切片制备、HE 染色和显微成像程序统一。所有样本的骨体积（BV）和组织体积（TV）均使用 ImageJ 手动测量。原始面积值四舍五入到四位小数。BV/TV 比值（以百分比表示）通过标准 Excel 公式（BV/TV × 100%）自动计算，并保留九位小数。整个过程未对最终比值数据进行手动输入或修改。

追溯原始分析电子表格发现，手动测量的 TV 值（蓝色背景和箭头标记，用于组间比较）和 BV 值（棕色背景和箭头标记，用于组间比较）在所有单个样本中均不同。此外，由固定公式生成的九位小数 BV/TV 比值显示，两组样本之间的尾数不同。例如，Nronflox/flox 组第一个样本（82683）和 sham 组第一个样本（83015）的尾数完全不同。为了统计绘图，所有值自动截断为六位小数。将这些六位小数数据上传到期刊数据库后，不同组样本之间的 BV/TV 值第 3 到第 6 位小数出现相同。

Response to #2

本节数据来自 qPCR 实验。同一组内的相同值是图形生成过程中两轮归一化的正常结果。进行了三次独立 qPCR 实验检测 Nron 基因表达。对于每次重复，第四组（黄色标记）用于第一次归一化。在整合三次独立实验的数据时，使用第一组（绿色标记）对所有重复中的所有组进行第二次归一化，以统一绘图参考。这种双重归一化程序导致第四组的值完全一致。

Response to #3

本节的统计值来自手动测量或仪器直接导出，分别解释如下。

（1）手动测量值取平均的解释

皮质骨厚度（Ct.Th）、矿化沉积率（MAR）和凋亡细胞比例是通过手动测量获得的统计值。对于期刊表格中呈现的小鼠皮质骨厚度和荧光双标记 MAR 统计数据，所有值均为多个测量点的平均值。Supplementary Figure 2f 中 Nronflox/flox 组小鼠的 Ct.Th 值由四个测量位点（Th1、Th2 和 Th4）平均得到。两个所示样本在各位点的测量值不同（见下方源表图片）。

相同的平均值是符合数学规则的客观计算结果。Supplementary Figure 2h 中显示的 MAR 值使用基于两个位点测量平均值的固定公式计算。两个提及样本在各位点的原始读数不同（在下方表格图片中用红色圆圈标记）。相似的最终 MAR 值是计算的自然结果。

同一组内小鼠之间相似或相同的 Ct.Th 和 MAR 值与生物学特征一致。所有 Nronflox/flox 实验小鼠均为同性别、同年龄的同窝仔，在标准化 SPF 设施中统一饲养，住房和喂养条件相同。这些指标的重叠数值结果代表正常的生理和实验现象。

（2）基于手动测量值用固定公式计算的数据解释

凋亡细胞比例使用固定公式计算：（死亡细胞数 / 总细胞数）× 100%。在破骨细胞诱导和培养过程中，破骨细胞体积大，需要严格的培养条件。当破骨细胞和凋亡破骨细胞总数较低时，个体样本中凋亡细胞计数和总细胞计数相同是正常的实验现象，因此导致计算出的凋亡细胞比例一致。两个受质疑的数据点用黄色高亮。对于两个样本，总计数细胞数均为 22，死亡细胞数均为 3，因此通过标准公式计算的凋亡细胞比例相同。

（3）仪器分析直接导出的原始数据解释

椎骨和股骨骨小梁的骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N）在组内和组间样本中值相同是正常观察。首先，这些参数均为 micro-CT 扫描和分析后仪器直接生成的客观结果。其次，不同样本中出现相同的 Tb.N 和 Tb.Th 值有合理的潜在原因。Micro-CT 以固定体素分辨率运行，产生离散测量值。当组织结构的细微差异低于仪器分辨率极限时，测量值将重合。此外，在整个扫描、重建、分割阈值、感兴趣区（ROI）选择和分析算法中，对所有样本应用了统一设置，确保整个批次的测量标准一致。此外，Tb.N 是基于计数的参数，可能值范围有限，而 Tb.Th 在正常小鼠骨小梁中固有生理变异较小。因此，对于该分析系统，样本之间的重复值是常见的。对于 Supplementary Figure 9b 中椎骨骨小梁参数，结果在 micro-CT 分析后导出为 PDF 文件。受质疑样本的 PDF 记录附后以供验证，红色箭头标记 micro-CT 的原始客观输出，其本质上是相同的。

在 Supplementary Figure 11c 股骨骨小梁 micro-CT 数据的原始导出电子表格中，三个所示样本（黄色标记）的一致参数是 micro-CT 分析产生的真实结果。

Response to #4

本节的统计值通过固定公式除法计算。对于通过除法得出的指标，如果分母为常数或共享整数倍关系，不同分子计算的结果通常会产生小数位相同的值。这是除法运算的正常数学性质。原始计算表的所有原始数据附在下方（用彩色背景标记）。具体而言，Supplementary Figure 5C 公式中的分母固定为 229.333（黄色高亮）。在 Supplementary Figure 8B 中，两个样本的分母 26 和 13（分别用蓝色和黄色标记）形成整数倍关系。对于 Supplementary Figure 10b，两组数据分别共享相同的分母 26（棕色标记）和 30.4（绿色标记）。给定相同或倍数相关的分母，最终结果中小数尾数的重叠是标准数学现象。

Response to #5

（1）关于个体样本间相同的数值差异

当通过除法计算指标时，如果配对样本的分子差值相同且分母相同，则最终结果的差值将相等。根据原始数据表，Supplementary Figure 5c 中 Ctrl 组和 Nron 组第一个样本的细胞计数差为 93，第三个样本的差也为 93。将这些值除以固定分母 229，必然产生数值差距相同的结果，这遵循基本数学规则。

关于 Supplementary Figure 9b 和 Supplementary Figure 11c 中的 micro-CT 数据，一些配对值可以通过加减常数得出。如前所述，所有统计结果均直接从 micro-CT 系统统一导出，原始文件图像附后供参考。系统误差是 micro-CT 扫描、阈值分割、3D 重建和定量分析中固有的。对于同一批次中连续测量的样本，仪器的光路、灰度阈值和分析模板保持不变，导致所有样本存在恒定偏移。样本放置、安装支架和扫描条件的微小变化也可能引入均匀的数值差异。因此，不同组数据之间的固定加减关系是仪器和分析工作流引起的正常系统误差，在 micro-CT 实验中非常常见。

（2）关于个体样本间相同的数值差异

在除法运算中，当两个数据集共享相同分母时，分子之间的比例关系将产生具有相应倍数关系的结果。根据原始分析表，Nron 组第 2 个和第 4 个样本（绿色标记）的分母均为 22，分子分别为 2 和 3，形成 1.5 倍关系。类似地，Nron 组第 3 个样本和 NCM2 组第 1 个样本共享分母 20，分子分别为 2 和 3，也显示 1.5 倍关系。本节所有统计结果均使用公式计算：（死亡细胞数 / 总细胞数）× 100%。其他类似情况不再赘述。

作者最后表示，如有任何问题，请随时联系通讯作者，将及时提供回复和解释。

评论 #3：评论者对作者回应的再回应

评论者 Amphiura duncani 在审查了论文数据和作者回应后，提出以下观察：

Point 1 – BV/TV 后五位小数（Fig 2e & Fig 7e）

作者将相同的小数结尾归因于手动测量、Excel 保留九位小数以及截断为六位小数。他们提供的截断前原始值为 5.438082683 和 5.838083015。截断为六位小数将得到 5.438082 和 5.838083，其后五位数字（38082 和 38083）并不相同。然而，已发表值为 5.438083 和 5.838083，其后五位数字（38083）相同。这种模式与四舍五入一致，而非截断，因此该解释无法说明已发表的数字。此外，这两个实验涉及完全独立的动物队列——基因敲除模型（Fig 2e）和卵巢切除诱导的骨质疏松模型（Fig 7e）——具有单独的饲养、组织处理、切片和手动测量。在这种独立条件下，两个数据集后五位小数匹配将非常意外。

Point 2 – Suppl Fig 5a 中三个相同的 Nron 值

作者指出两轮归一化产生了三个相同的值。在 qPCR 分析中，归一化分别应用于每个独立实验，通常通过缩放到参考样本。这种重新缩放并不能消除独立重复之间固有的生物学和技术变异。如果三个独立实验的原始 Ct 值不同，归一化值仍将反映这些差异。要从三个独立实验获得完全相同的归一化值，需要原始值也基本一致——这在生物学重复中并不典型。因此，应提供每个实验的原始 Ct 值和未归一化表达数据。

Point 3 – 组内和组间重复数字

作者对重复数字提供了若干解释。对于 Ct.Th 和 MAR，他们指出相同的平均值来自多个测量点的平均。对于凋亡百分比，他们指出两个样本恰好有 22 个总细胞和 3 个死亡细胞，导致计算百分比相同。对于 Tb.N 和 Tb.Th，他们将重复值归因于有限的仪器分辨率和统一的扫描参数。每种解释单独来看可能看似合理。然而，当所有重复数字一起考虑时——跨越平均值、细胞计数和 micro-CT 参数——很难将每个实例都归因于这些单独原因。例如，如果仪器分辨率如此有限以至于值重复，那么报告四到五位小数就与该有限分辨率不一致。此外，几个独立小鼠具有完全相同的平均皮质厚度，或两个样本具有完全相同的总细胞和死亡细胞计数，将代表极不可能的巧合。

Point 4 – 整数部分不同但小数部分相同

作者解释，用固定分母（例如 Suppl Fig 5c 中的 229.333）除法可以产生即使整数部分不同但小数部分相同的结果。尽管数学上合理，但这种解释忽略了分子的固有变异性。这些计算中的分子来自实际的生物学测量（细胞计数等），包含随机变异。即使分母固定，分子的微小波动也会改变结果的小数部分。要使多个独立样本的小数部分相同，分子必须以高度特定、非随机的方式变化——例如，相差分母的精确倍数。

Point 5 – 固定常数算术规则

作者指出相同的分母和 μCT 仪器的系统误差来解释精确的乘法与加法关系。每种解释单独来看可能合理。然而，同一图中同时存在 1.5 倍和 2.25 倍关系，以及不同比较之间不同的常数偏移——有些为正，有些为负——使得整体模式更难与常规测量行为相协调。在测量科学中，系统误差通常以相同方向、大致相同幅度影响批次中的所有测量。它不会产生不同组比较的不同常数偏移，如这里所观察到的。

作者的回应引用了截断、归一化、平均、分母关系和系统误差等程序细节。然而，仔细检查表明，这些解释要么与已发表数字不符（截断与四舍五入），要么依赖于与典型生物变异和测量理论不一致的假设。

评论 #4：从概率角度的观察

评论者 Oxynoemacheilus phoxinoides 针对 Point 1 指出：

作者声称匹配的小数结尾来自四舍五入。作者提供了原始九位小数值，四舍五入后产生已发表的匹配序列。在十进制数字均匀分布的假设下，两个独立测量值四舍五入到六位小数后，第 2 至第 6 位（五位数字）完全相同的概率为 1/100,000。对于两个独立队列（不同动物模型、单独饲养、组织处理和测量）之间的六对比较，在相同均匀性假设下，联合概率为 1/10^30。

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